干货｜菌（毒）种鉴定指导原则与鉴定方法
【2023-01-16】
菌毒种系指直接用于制造和检定生物制品的细菌、真菌、支原体、放线菌、衣原体、立克次体或病毒等，包括各种经过基因工程修饰的菌毒种。
——生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制《中国药典》2020年版
菌毒种作为重要的实验材料被广泛应用于诊断试剂、药物筛选、疫苗及生物制品研发等领域，其质量直接影响科研及生产结果的准确性，若使用的菌毒种有误或者存在污染，将对结果造成严重影响；因此，菌毒种资源所对应的信息准确、完整与否，亦是生物制品质量审评的重要关卡。
《中国药典》规定，生物制品生产用菌毒种应采用种子批系统，并应尽量减少传代次数，以降低发生遗传变异的风险。工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5代（从菌种保藏机构获得的标准菌株为第0代）；原始种子应验明其历史、来源（包括重组工程菌毒种的构建过程）和生物学特性。美国药典（USP）部分标准要求从保藏机构获取的菌毒种传代不能超过5代。美国临床实验室标准化协会（CLSI）-M22-A3要求不能超过7代。
开展菌毒种质量控制，对生产用菌毒种进行生物学特性、生化特性、血清学试验和分子遗传特性等的检定，确保生产用菌毒种的检定符合各论要求。
生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制《中国药典》2020年版
以下主要介绍菌毒种鉴定中的分子生物学方法。
菌毒种鉴定——表型特征方法
表型微生物鉴定依据表型特征的表达来区别不同微生物间的差异，通过比较微生物的菌落形态、理化特征和特征化学成分与典型微生物的差异进行鉴别。
表1 微生物分类中常用的表型特征
菌毒种鉴定——分子生物学方法
与表型特征不同，应用分子生物学方法通常不受生长培养基或分离物活性的影响，只需分离到纯菌落便可用于分析。由于大部分微生物物种中核酸序列是高度保守的，所以16S rRNA核酸测序、18S rRNA核酸测序、ITS核酸测序和全基因组核酸测序等“系统发育结构”鉴定方法理论上更值得信赖。
表2 微生物分类学的基因型/系统发育的特征
细菌16S rRNA基因序列和真菌的ITS核酸序列在结构和功能上具有高度保守性，是微生物核酸测序鉴定和分类中广泛应用的DNA特征性核酸序列，方法易标准化，鉴定结果可以满足一般菌种鉴定的要求。对16S rRNA（全长约1500bp）和ITS（ITS1与ITS2）全长序列进行PCR扩增，电泳分离扩增产物后纯化，纯化产物使用sanger法进行序列测定，然后与公用数据库（NCBI）进行比对，进行菌种鉴定。
不过16S rRNA等标签基因，一般能够鉴定到种的级别，若是确认同种中的两个相同株需要比对更多的基因序列或特征基因片段，甚至是全基因组序列的比对来保证结果的准确性。
16S F端测序峰图示例
16S R端测序峰图示例
序列比对结果
全基因组核酸测序可以得到菌株核酸水平的全部遗传信息，通过核酸序列的比对分析，进行菌株的鉴定、功能挖掘及安全性评价等分析。2020 版《中国药典》人用基因治疗制品总论要求应保证起始原材料的遗传稳定性，并基于细胞库/种子批经长时间培养或多次传代后产物的完整性和一致性。在特定情况下因某些位点产生突变造成序列与理论不符，应提供不影响目的基因表达和制品质量的证据。全基因组核酸序列检测方法对遗传变异的分析能够及时发现尚未导致表型改变、但核酸已发生变异的情况，从而进行处置，避免因菌毒种变异而影响实验活动。
食品和饲料安全基因组学跨机构合作组织编写的“Use of Whole Genome Sequencing by the Federal Interagency Collaboration for Genomics for Food and Feed Safety in the United States”描述了美国国立卫生研究院、卫生与公众服务部、疾病控制和预防中心（CDC）和美国食品和药物管理局（FDA），以及美国农业部、食品安全和检验局、农业研究局和动植物卫生检验局之间的食源性病原体分析、调查和协调工作。指出使用单核苷酸多态性（SNP）方法评估基因内（编码）和基因间（非编码）的变异，根据广义的法则与WGS数据比对，≤20 SNPs 用于判定是否为同一菌株，且FDA在其GenomeTrakr nerwork中也是基于SNP的方法进行菌株鉴定。
阅微基因菌毒种鉴定-全基因组测序方法，将待检样本与参考样本比对，统计两者间SNP/突变位点数量并判定是否为同一株系（≤20 个SNP位点判定为同一株系来源，>20个SNP位点判定为非同一株系）。可接收样本类型为核酸与菌种沉淀，病毒类样本鉴定只接收核酸。
对SNP/突变位点的注释，辅助判定突变是否会影响表达产物：
菌毒种的鉴定应根据实际的需求以及所要达到的鉴定水平（属、种、株），选择最适合要求的鉴定技术，必要时可采用多种鉴定方法进行确认。
质量控制是产品安全、有效的重要保证和产业化进程中的重要环节之一，阅微基因可提供细胞特性、功能性、纯度、安全性等分析，从药典推荐方法到快速检测方法满足不同阶段的研发需求，同时为研发型药企及CXO企业提供从质控、基因分析到临床基因分型方法的验证开发。
阅微基因质控检测项目表
参考文献：
[1] 2020 中国药典
[2] 2021 基因修饰细胞治疗产品非临床研究与评价
[3] 2021国家干细胞转化资源库标准规范
[4] 2021人源性干细胞产品药学评价与评价技术指导原则（征求意见稿）
[5] 《科学研究中规范使用病原微生物菌(毒)种专家共识》编写组，国家病原微生物保藏中心/国家 病原微生物资源库. 科学研究中规范使用病原微生物菌(毒)种专家共识[J]. 中华医学杂志, 2022, 102(40): 3174-3180. DOI: 10.3760/cma.j.cn112137-20220701-01463.
[6] The United States Pharmacopeial Convention. U.S. Pharmacopeia 37-NF 32[s]. Rockville MD: The United States Pharmacopeial Convention, 2013.
[7] Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Quality control for commercially prepared microbiological culture media[EB/OL]. [2022-04-26].
[8] Whole Genome Sequencing (WGS) Program-FDA
