微卫星不稳定（MSI）检测的位点如何选择？
【2021-12-16】
自2017年帕博利珠单抗被FDA批准用于治疗dMMR/MSI-H型不可切除或转移性经治的实体瘤患者，微卫星不稳定（MSI）成为全球首个指导肿瘤免疫治疗的泛癌种分子标志物，对肿瘤的诊断和治疗有深远的临床价值。据报道人类基因组中有1900万个微卫星位点，而错配修复系统缺陷并不会导致所有的微卫星位点不稳定，所以在MSI检测时选择高灵敏性和高特异性的微卫星位点尤为重要。
01 MSI检测位点由双核苷酸位点向单核苷酸位点进化
1997年，美国国家癌症研究所（National Cancer Institute，NCI）提出了包括2个单核苷酸位点和3个双核苷酸位点的5位点评价系统（BAT-26、BAT-25、D5S346、D2S123、D17S250）[1]。此次位点建议为开放性建议，会议同时提出了其他位点作为备选。传统的NCI panel虽然一直被沿用，但其中双核苷酸位点敏感性与特异性低，对MSI-H的检出率只有60%~80%；同时对于MSH6突变引起的MSI的检出率低；并且双核苷酸位点本身更趋于不稳定，对结果判读难度增大，容易得到错误分类结果等方面的争议一直存在。
2002年，Suraweera等提出pentaplex panel，该panel中的5个单核苷酸位点（BAT-26、BAT-25、NR-21、NR-22、NR-24）在结直肠癌中检测灵敏度均在95%以上[2]。2004年，pentaplex panel 升级为BAT-26、BAT-25、NR-21、NR-24、NR-27，多重体系可以更好地区分每个位点[3]，同时对于MSH6缺陷的结直肠癌有更高的灵敏度。同年，该panel被修订版Bethesda指南推荐，同时指南指出对于传统NCI panel，如果只有双核苷酸位点发生突变，需要增加单核苷酸位点的数量，来排除MSI-L[4]（见下图重点标注部分）。
2004年修订版Bethesda指南 J Natl Cancer Inst.
2004年，Bacher等人在266个位点中筛选了敏感性和特异性最高的5个单核苷酸panel（BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、MONO-27）[5]。
至此基于PCR法的单核苷酸标志位点BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、MONO-27等被认为具有较高灵敏度和特异性，在临床广泛使用。据美国病理学会（CAP）室间质评数据显示，2012年单核苷酸位点panel的使用率超七成[6]。
02 单核苷酸panel与免疫治疗
K药获批
从2015年新英格兰杂志首次报道MSI与免疫治疗疗效相关，到2017年5月FDA批准K药用于后线治疗MSI-H泛实体肿瘤，再到2020年6月FDA批准K药单药用于不可切除或转移性MSI-H/dMMR结直肠癌患者一线治疗，相关临床研究均使用了单核苷酸Panel。回顾几个关键临床研究：KeyNote016/164/012/028/158/177，其中MSI检测均采用单核苷酸panel（BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、MONO-27） [7,8]。
KeyNote 158临床研究文章
O药/Y药获批
基于CheckMate142研究，FDA分别批准纳武利尤单抗（Nivolumab，O药）单药及联合低剂量CTLA-4抑制剂伊匹木单抗（YERVOY，Y药）用于MSI-H/dMMR 结肠直肠癌患者的治疗。在O药获批的关键临床研究CheckMate142中，中心实验室均采用荧光PCR-毛细管电泳法进行MSI验证，位点采用改良版的Bethesda panel（NCI Panel+ TGFβR2突变）进行检测 [9,10]。
从这些临床研究中我们发现K药临床试验中MSI检测均采用全单核苷酸panel，而O药临床试验中由于单独使用NCI panel无法满足MSI检测准确性的要求，所以额外添加了TGFβR2突变检测进行MSI的确认。
03 国内外指南及共识逐渐推荐单核苷酸panel
单核苷酸位点由于其更高灵敏度和特异性，已被修订版Bethesda指南、NCCN、ESMO和国内专家共识联合推荐。
早在2004年修订版Bethesda指南指出单核苷酸panel——Pentaplex penal（BAT-26、 BAT-25、NR-21、NR-27 、NR-24）对MSI-H肿瘤的敏感性可能高于其他微卫星标记，推荐用于林奇综合征筛查[4]。
随着免疫治疗的发展，2019年8月ESMO发布癌症免疫治疗专家共识，推荐单核苷酸panel——pentaplex penal（BAT-26、BAT-25、NR-21、NR-27、NR-24）进行MSI检测以指导免疫治疗[11]。
2019年结直肠癌及其他相关实体瘤微卫星不稳定性检测中国专家共识指出，基于PCR法中的pentaplex panel的5~7个标志位点组合BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27、MONO-27和NR-22被认定为PCR-MSI检测的金标准，值得指出的是这些位点均为单核苷酸位点[12]。
《2019年中国结直肠癌及实体瘤MSI检测专家共识》
2021年NCCN胃癌指南中MSI检测除了推荐NCI panel外，还推荐了单核苷酸位点panel[13]。
04 阅微基因单核苷酸panel性能优异
自2012年获得国内首个MSI检测发明专利以来，阅微基因微卫星不稳定基因检测试剂盒经过数万例临床样本验证及严谨的注册临床试验，于2021年11月正式获批国家药品监督管理局第三类医疗器械注册证（国械注准20213400936），是国内首款基于全单核苷酸位点（BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27、MONO-27）的MSI检测试剂盒。
本产品的注册临床试验由中国医学科学院肿瘤医院牵头，复旦大学附属肿瘤医院和四川大学华西医院三家顶尖肿瘤医院共同参与，累计完成1000多例的临床样本验证。本次临床试验选用的参比试剂是已获得FDA批准用于PD-1伴随诊断的罗氏 Ventana MMR RxDx Panel试剂，与MMR蛋白免疫组化对比阳性符合率94.79%，阴性符合率98.89%，总符合率97.25%，完全符合国家药监局最新的MSI审查指导原则。针对MMR胚系突变检测阳性样本，本产品检出率为100%。
在注册临床试验中，本产品同时与Promega产品进行了头对头研究，总符合率99.75%（P=1），证明本产品与Promega产品具有等效性。若以免疫组化为金标准，阅微基因产品的灵敏度和一致性略优于Promega产品（灵敏度：97.99% vs 97.66%；一致性：97.78% vs 97.54%）。
阅微基因与国内多家医院合作，针对阅微基因全单核苷酸panel与NCI panel在中国人群中的性能进行了对比研究。结果显示，阅微基因的单核苷酸Panel优于NCI panel（灵敏度：94.13% vs 89.39%；特异度：98.52% vs 98.41%），并且单核苷酸panel具有灵敏度高、特异度高、单态性高、易于判型等优势，大大节省了病理科医生的时间和人力成本。
05 总结
从MSI位点灵敏度特异度研究到免疫治疗临床研究再到指南发展更替可以看出，单核苷酸panel由于优秀的灵敏度和特异度而在林奇综合征筛查、免疫用药指导方面越来越受到临床认可，在MSI临床应用检测时一定要选择经过临床验证的位点，从而保证检测结果的准确。
参考文献
[1] Boland CR,et al. A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res. 1998 Nov 15;58(22):5248-57.
[2] Suraweera N,et al. Evaluation of tumor microsatellite instability using five quasimonomorphic mononucleotide repeats and pentaplex PCR. Gastroenterology. 2002 Dec;123(6):1804-11.
[3] Buhard O, et al. Quasimonomorphic mononucleotide repeats for high-level microsatellite instability analysis. Dis Markers. 2004;20(4-5):251-7.
[4] Asad Umar, et al. Revised Bethesda Guidelines for Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer (Lynch Syndrome) and Microsatellite Instability. J Natl Cancer Inst. 2004;96(4):261-8.
[5] Jeffery W Bacher, et al. Development of a Fluorescent Multiplex Assay for Detection of MSI-High Tumors.2004;20(4-5):237-50.
[6] Boyle TA, et al. Summary of microsatellite instability test results from laboratories participating in proficiency surveys: proficiency survey results from 2005 to 2012. Arch Pathol Lab Med. 2014 Mar;138(3):363-70..
[7] Le DT, et.al. PD-1 Blockade in Tumors with Mismatch-Repair Deficiency. N Engl J Med. 2015 Jun 25;372(26):2509-20.
[8] Marabelle A,et al. Association of tumour mutational burden with outcomes in patients with advanced solid tumours treated with pembrolizumab: prospective biomarker analysis of the multicohort, open-label, phase 2 KEYNOTE-158 study. Lancet Oncol. 2020 Oct;21(10):1353-1365.
[9] Overman MJ,et al. Nivolumab in patients with metastatic DNA mismatch repair-deficient or microsatellite instability-high colorectal cancer (CheckMate 142): an open-label, multicentre, phase 2 study. Lancet Oncol. 2017 Sep;18(9):1182-1191.
[10] Overman MJ,et al. Durable Clinical Benefit With Nivolumab Plus Ipilimumab in DNA Mismatch Repair-Deficient/Microsatellite Instability-High Metastatic Colorectal Cancer. J Clin Oncol. 2018 Mar 10;36(8):773-779.
[11] Luchini Cet al. ESMO recommendations on microsatellite instability testing for immunotherapy in cancer, and its relationship with PD-1/PD-L1 expression and tumour mutational burden: a systematic review-based approach. Ann Oncol. 2019 Aug 1;30(8):1232-1243.
[12] 结直肠癌及其他相关实体瘤微卫星不稳定性检测中国专家共识.实用肿瘤杂志 2019第34卷 第5期
[13] 胃癌NCCN指南 2021 V3
