随着社会人口老龄化进程的加速，中国的心血管疾病占城乡居民总死亡危险因素之首，且患病人数还将在今后10年内呈快速增长态势。目前全国约有心血管病患者2.9亿，也意味着每5个成人中便有1人患心血管病。而随阅微心血管用药指导基因检测产品的大力推广， 大阅哥也跻身到了解决我国心血管疾病这个严重问题的队伍当中。于是乎，最近热衷非编码RNA 不能自拔的大阅哥再也按捺不住，想看看心血管疾病研究在非编码RNA领域有哪些成果呢？

与心血管疾病相关的非编码RNA研究不少，范围涵盖了miRNA，lncRNA和circRNA，其方法和思路也是多种多样，为从分子层面上了解非编码RNA在相关疾病中的作用机制及潜在治疗方法的发展奠定了基础，并提供了新的视角！

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与心脏疾病相关的miRNA研究较为成熟，近年更多研究偏向以anti-miRNA或过表达方法干预特定miRNA，

以达到治疗目的。下表对miRNA在心脏疾病上的关联和潜在治疗效果做出了总结：

lncRNA研究相对miRNA起步较晚，大部分还处在探究lncRNA与心血管疾病之间关联的层面：

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环小弟circRNA

circRNA的研究更新，相较于lncRNA和miRNA研究发表的数量不多。主要研究内容包括了“环形RNA CDR1as可以充当miR-7的分子海绵；环形RNA HRCR可以充当mi233的分子海绵；环形RNA Foxo3在高龄的心脏病人和小鼠中显著高表达；和circRNA测序鉴定出575中种与心脏疾病相关的候选circRNA等”。

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通过阅读文献，大阅哥总结了以下非编码RNA和心血管疾病研究的思路：

  lncRNA经典思路

通过高通量测序或基因芯片的方法对不同组别样品中的 lncRNA及mRNA进行探究，以找到具表达差异的lncRNAs鉴定或探究新的lncRNAs。由于几乎没有探讨机制，文章点数较低。

案例(1)

通过芯片方法鉴定小鼠心肌梗塞后lncRNA的表达变化，找到可能与心梗后左心室重塑相关的lncRNAs。

Zangrando, Jennifer, et al. "Identification of candidate long non-coding RNAs in response to myocardial infarction." BMC genomics 15.1 (2014): 460. (IF:3.7)

实验思路

1.实验设计：4只心肌梗塞小鼠，4只对照组小鼠心脏样品；

2.lncRNA芯片检测：筛选2倍以上差异表达lncRNAs(20个显著上调和10个显著下调lncRNA)；

3.qRT-PCR验证：从2中再挑选出上下调前5的共10个差异表达最显著的lncRNAs 进行qRT-PCR验证, 得到验证结果最显著上调的2个lncRNAs：MIRT1, MIRT2；

4.FISH定位：对 MIRT1 进行原位杂交在心脏中定位；

5.功能预测：为验证MIRT1 和MIRT2 在心梗后左心室重塑的机制，选取数据库中与左心室重塑有关的47个基因(38个在芯片中被鉴定出来)，利用软件预测lncRNA：MIRT1 和MIRT2与38个基因的关系。

案例(2) 

在小样本量 training set 的RNA测序结果中找出的差异基因，与大样本量的芯片分析结果 (test set) 比对，认为高通量测序方法在只有极小样本数的情况下也可能达到良好的复杂疾病区分效果。

Liu, Y., Morley, M., Brandimarto, J., Hannenhalli, S., Hu, Y., Ashley, E.A., Tang, W.W., Moravec, C.S., Margulies, K.B., Cappola, T.P. and Li, M., 2015. RNA-Seq identifies novel myocardial gene expression signatures of heart failure. Genomics, 105(2), pp.83-89. (IF：2.8）

实验思路

1.实验设计：2种心脏病，缺血性心脏病患者(ISCH)，扩张型心肌病患者 (DCM)，及健康个体(NF)的心脏组织；

2.RNA-Seq 测序：6个样本(含1 ISCH，2 DCM和3 NF)；

3.芯片：313个样本(含95 ISCH，82 DCM和136 NF)；

4.对 RNA-seq 数据进行两两对照分析，利用Cufflinks找出差异基因；利用交集方法选取各组中任意两两样品间共同存在差异表达的基因，分别确定70/12/129个基因的三种panel，用来区分ISCH/NF，DCM/NF和ISCH/DCM；

5.由测序数据建立起的基因panel作为K-means 聚类方法的feature vector，验证芯片数据，结果发现可很好的区分疾病和健康人群(ISCH/NF，DCM/NF)，但对两种心脏病间(ISCH/DCM)区分效果不尽理想。作者分析了可能的原因；

6.分别从功能、转录因子及GWAS loci 三个层面分析 RNA-seq 差异基因。

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  circRNA 经典思路

通过测序或芯片对不同样品中的circRNA进行探究，以找到差异表达的circRNAs，鉴定新circRNAs，或与其他显著差异基因相关的circRNAs为目的。由于circRNA的研究相对少，如果实验设计具有新颖性，即使没有功能鉴定，文章点数也可能上到5分。下面这篇文章中倚重的CIRI平台大阅哥在前几期文章中不只一次提到哦。

案例：

利用circRNA测序阐述在不同心脏疾病样本中circRNA表达全景。

Tan, Wilson LW, et al. "A landscape of circular RNA expression in the human heart." Cardiovascular research113.3 (2017): 298-309. (IF:5.8)

实验思路

1.实验设计：12个患者心脏组织样本(3肥厚心肌病，3局部缺血心脏病，3扩张性心肌病，3个健康者)25个心室肥大症小鼠模型心脏样本组织(N=12~13)，外加人胚胎干细胞分化的心肌细胞(hESC-CM)的不同分化天数；

2.环状RNA测序：对以上样本全部进行核糖体及线性RNA去除的方法进行环形RNA测序；

3.利用CIRI平台对测序结果的中circRNAs进行鉴定，共鉴定出15,318个人的和3,017个小鼠的 circRNAs，发现大部分(~80%)的circRNAs 来源自编码或非编码线性基因的外显子序列；

4.全景描绘：分析其表达丰度，鉴定circRNA来源基因的种类、长度、外显子数目等，鉴定其组织特异性及GO富集分析、其中最长的人源TTN基因居然可以产生多达401种circRNA isoform；

5.验证：利用qRT-PCR和FISH方法对表达丰度覆盖高中低的30个人及20个小鼠的circRNA进行鉴定和细胞定位，成功验证24个人的和19个小鼠的circRNAs；

6.表达趋势分析：有趣的是，作者在不同心脏疾病间几乎找不到显著差异表达的 circRNA, 但是在胚胎干细胞分化的过程中却有显著变化。揭示了circRNAs 参与在心脏的发育过程之中。

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  非编码RNA功能研究经典思路

利用实时荧光定量(qRT-PCR)的方法探究表达量，结合其他技术，如原位杂交，表达干预、载体构建等，探究非编码RNA的功能。下面这篇案例虽没有进行高通量分析，但结合已知的研究结果，成功将lncRNA 和已知的miRNA关联在一起，很快得到发表。

案例：

已知在心脏肥大小鼠中的表达量显著提升的lncRNA：ROR，本研究下调其表达量可减缓心脏肥大。并发现当敲除lncRNA-ROR时，miR-133的表达量提升。结合以上得出结论，lncRNA-ROR通过与miR-133相互作用导致心脏肥大，为潜在治疗靶点。

Jiang, F., Zhou, X. and Huang, J., 2016. Long non-coding RNA-ROR mediates the reprogramming in cardiac hypertrophy. Plos One, 11(4), p.e0152767.(IF：2.8)

实验思路

1.确认表达趋势：利用qRT-PCR在动物及细胞模型中检测 lncRNA-ROR 均上调。(心脏肥大模型小鼠(N=10)，PE诱导培养的心肌细胞)；

2.在上述模型中以WB检测心室肥大模型标志蛋白ANP和BNP也显著上调；

3.建立编码蛋白调控关联：在培养的心肌细胞中敲除lncRNA ROR 后，ANP和BNP表达量降低；

4.建立miRNA调控关联：利用qRT-PCR测定数个已知与心脏肥大致病相关的miRNA表达，发现miR-133与 lncRNA-ROR 表达呈负相关；利用 miRNA mimic, 及 ROR MRE 突变载体验证 miR-133 与 ROR 直接作用；

5.过表达 miR-133：过量表达 miR-133，成功下调 ROR 及ANP/BNP蛋白表达。推测lncRNA-ROR可能透过充当miR-133的分子海绵参与了心脏肥大疾病的进程。

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  高阶联合研究思路

通过全转录组联合分析探究 circRNA 与其他非编码RNA的互作研究。

案例(1) 

探究circRNA作为miRNA的分子海绵，揭示其机制在心脏疾病中所起到的作用。

Wang, Kun, et al. "A circular RNA protects the heart from pathological hypertrophy and heart failure by targeting miR-223." European heart journal 37.33 (2016): 2602-2611. (IF:19.695)

实验思路

1.芯片：利用miRNA芯片探究在心脏肥大心衰小鼠中差异表达的miRNAs，选择上调显著的 miR-233；

2.动物模型：构建miR-233的敲减和过表达的转基因小鼠，验证miR-233的表达增加心脏肥大和心衰风险；

3.细胞模型：在心肌细胞培养中过表达miR-233或对其进行基因敲除，结果与动物模型相印证； 

4.miRNA 靶基因in细胞模型：利用WB验证miR-233的靶基因为ARC , 并构造荧光素酶载体对ARC和miR-233的关系进行验证；

5.miRNA 靶基因in动物模型：构建了没有3’UTR区域的ARC转基因小鼠进一步验证了miR-233 调控ARC在心脏肥大心衰的作用；

6.关联 circRNA：随机选择100个已知circRNAs，以qRT-PCR验证其中36个在心脏中表达。其中一个circRNA(HRCR)在模型中显著下调且具有miR-233结合位点，利用pull down实验验证其与miR-233直接作用；

7.验证 circRNA 分子海绵：通过构建HRCR和ARC载体验证之间关系，证明HRCR充当miR-233的分子海绵。

案例(2)

 利用先前研究的lncRNA和circRNA测序数据建立四个不同心脏分化时期的基因网络图谱。

Li, Yongsheng, et al. "Dynamic organization of lncRNA and circular RNA regulators collectively controlled cardiac differentiation in humans." EBioMedicine 24 (2017): 137-146.

注：EbioMedicine是Lancet旗下的新子刊之一，预计影响力因子约10分。

实验思路

1.利用先前研究中的lncRNA测序数据，对心脏细胞分化的四个不同时期进行分析；

2.提取先前研究中的circRNA数据，并对数据进行生物信息学的分析；

3.circRNA，lncRNA的PCA聚类分析；

4.不同心脏细胞分化时期特异性表达的lncRNA和circRNA筛选分析； 

5.不同心脏细胞分化时期特异性表达的lncRNA和circRNA功能分析；

6.构建不同心脏细胞分化时期的基因网络。

lncRNA，circRNA与gene在心脏细胞分化不同时期的相互作用关系网络图。可以看出，在ESC，CM时期，lncRNA，circRNA与gene之间相互作用发生相对较多。

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通过大阅哥的思路整理，是否对心血管疾病与非编码RNA研究有了更深一层的理解呢？

如果您的研究领域需要大阅哥帮忙，欢迎留言给大阅哥派工作哦！

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本期彩蛋

qRT-PCR：可以用来验证非编码RNA的表达量；

miRNA mimics和miRNA inhibitors： 模拟生物体内源的miRNAs，增强内源性miRNA的功能或专门抑制特异的靶miRNA；

RIP或RNA pull down：用抗体抓下RNA，拿到纯化的RNA做qRT-PCR，可以验证物理上非编码RNA和mRNA或某种蛋白的结合关系；

荧光素酶实验：在荧光素酶报告基因载体的报告基因编码区的下游插入ncRNA或者mRNA的3’UTR区，然后将构建好的载体转染细胞并改变细胞中相应miRNA的表达水平，通过检测荧光素酶的表达情况以分析ncRNA或者mRNA的3’UTR区中是否含有miRNA的靶位点；

FISH(原位杂交实验)：验证RNA在细胞表达的位置；

Western Bolting(WB)：蛋白质印记，获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。用来验证与miRNA相关蛋白的表达情况；

特定载体的合成或构建：个性化的了解各基因之间的关系。

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