疾病治疗类的肠道菌群研究，该怎么设计？
【2020-08-07】
疾病治疗是肠道菌群中很常见，也是和临床密切相关的一类研究，包括用药治疗、手术治疗、饮食干预、益生菌益生元协助、粪菌移植（FMT）等。本文将通过两篇最新的疾病治疗文献，来详细解析一下肠道菌群疾病治疗的思路和研究趋势。
疾病治疗通用试验设计流程
案例1
宏基因组+代谢组研究手术治疗后肠道菌群变化
研究内容：胃癌切除术后肠道菌群和代谢组变化
发表时间：2020年3月
发表期刊：Gut（IF：19.8）
胃切除术是一种治疗胃癌和病态肥胖的外科手术，众多研究表明术后粪便微生物组和代谢组改变会持续一段时间；特别是，这些改变与患者的术后并发症发生相关。该研究采用宏基因测序与代谢组学检测的方法对胃癌患者胃切除术后的肠道菌群变化进行研究。
实验设计
实验设计流程图
临床信息跟踪，PERMANOVA分析
在进行术后患者和健康者招募时，课题组详细记录了入组者的年龄、性别、BMI、血清葡萄糖、总胆固醇、病史等临床参数，并对这些临床参数进行了PERMANOVA和MaAsLin分析。结果表明，不同分组参与者的微生物差异和代谢差异比其他临床参数都能更好地解释分组之间的差异。
胃切除术后和健康对照临床信息表
文章评述
该研究利用宏基因组测序和代谢组学检测的方法对胃切除术后的肠道菌群和代谢产物变化进行了分析，并运用不同的生信算法来相互辅助验证。最终根据结果构建出了胃切除术后肠道微生物组和代谢产物改变的原理图，完善了该研究机制，为胃癌切除术治疗奠定了理论基础，提供了新观点。
该研究是近期发表的一篇非常有借鉴意义的肠道菌群疾病治疗研究，其中能够给我们一些启发：
01 临床参数的PERMANOVA分析
在肠道菌群的研究中，对入组参与者的常规信息和临床信息进行PERMANOVA分析十分必要，这样可以了解到这些参数是否对组间差异有着比菌群和代谢物更大的贡献。如若发现有此类参数，则需要先对这些参数进行效应混杂处理，待消除影响后，再去分析菌群和代谢组的数据。
02 不同生信方法间互相佐证
该研究采用了不同的生信分析方法来相互佐证分析结果，消除由于只使用一种生信分析的方法产生的误差，非常值得借鉴。例如宏基因组物种注释中同时使用mOTU以及MetaPhlAn2，功能注释使用pipeline以及HUMAnN2，两组学相关性分析使用的SparCC、Speaman以及MIMOSA等。
03 多组学关联分析
该研究采用了“微生物基因组学+代谢组学联合分析”的方法，并将两个组学进行了关联研究，得出的结果更加明确、有深度。
案例2
宏基因组测序预测用药治疗应答菌群标记物
研究内容：利用肠道菌群的组成与功能预测患者肿瘤治疗的应答
发表时间：2020年4月
发表期刊：Microbiome（IF：11.6 ）
多项研究表明肠道菌群可能影响肿瘤治疗效果。香港大学徐爱民团队在26名患有不同类型的肿瘤患者中发现，对治疗产生应答的患者其肠道菌群多样性、组成及功能均显著不同于不应答的患者。同时，在应答患者中显著富集的2个菌种可显著提升靶向治疗药物——厄洛替尼在肺癌小鼠模型中的疗效。另外，结合治疗前的肠道菌群组成与功能，并基于机器学习算法的模型，可较准确地预测患者对于肿瘤治疗的应答情况。
实验设计
实验设计流程图
排除不同肿瘤类型与治疗方法因素干扰
基于宏基因组测序结果，课题组利用Circos图的分析方法对26个患有不同肿瘤的患者进行聚类分析。结果显示相同肿瘤类型的患者没有聚类到一起，也没有按照治疗方式聚类到一起，这说明肿瘤治疗不会显著影响到治疗组的肠道菌群特点。同时，得知肿瘤病人和健康人的肠道菌群构成有着显著差异。应答组（R）比不应答组（NR）有着更高的多样性，应答组和健康组的肠道菌群组成更接近。
A.实验设计示意图，Circos聚类图
B.不同分组菌种多样性指数箱线图
C,D. 治疗后应答组与不应答组，健康对照组NMDS分析图
疾病治疗预测标记物模型构建与小鼠验证
A.随机森林模型图 B.不同分组用药后肿瘤大小 C.不同处理组的肿瘤大小
随机森林模型显示，利用菌种信息和代谢通路信息的组合，相较于单一因素的预测，可以显著提升预测结果，其AUC可达0.895。小鼠模型研究表明在应答患者中显著富集的2个菌种可显著提升靶向治疗药物——厄洛替尼在肺癌小鼠模型中的疗效，这可能是通过提升免疫T细胞募集中的趋化因子表达来实现的。
文章评述
该项研究利用肠道菌群的组成与功能预测患者肿瘤治疗的应答，将疾病治疗和筛找标志物的研究融合在一起，最后得出了很好的结论并加以验证。其中值得我们学习的点有很多，大阅哥总结了一下几点：
01 详细临床指标记录，跟踪用药后情况
本研究详细的记录了所有患者的临床信息、用药情况，并且持续跟踪用药后的疗效。这是疾病治疗类研究非常重要的工作。
02 大胆尝试，排除变量干扰
本研究利用临床资源选取了26个患有不同癌症并且采用不同治疗方式的患者进行研究，这是一种非常大胆和冒险的方式，因为可能会因变量太多而导致分析受阻，但该研究用细致的分析一一排除了癌症肿瘤和治疗方式不同的干扰。
03 挑选用药应答预测标志物并建模
研究在构建随机森林模型时，尝试把菌种和代谢通路两个单独的参数组合起来，提升了分辨率，值得参考。
04 特定菌种小鼠验证
由于本研究最终落到了预测用药疗效的标志物筛找上，因此做了小鼠验证，使整个文章更加完善。
总结
在疾病治疗类的肠道菌群研究设计上，已经注意以下几个要点：
■ 治疗多阶段的持续跟踪：无论何种治疗方式，最好能在实验设计阶段做好规划。疾病治疗是需要持续追踪的，例如治疗前、治疗中、治疗后。同时对于效果也要加以区分，例如是否对药物有应答、是否耐药、药物效果如何等。持续跟踪随访、阶段性调查是疾病治疗中很关键，是决定实验结果好坏的重要因素。
■ 运用多种组学方法，加入多因素、多指标：疾病标志物的菌种，肯定是越精细越好。所以目前疾病标志物的筛选，从方法来看已经是16S向宏基因的转变。从关注点上来看，16S精细到菌种水平已经不够了。宏基因组可以给更多的信息，包括基因、功能、并进行基因组的binning。
■ 高水平的疾病治疗研究最终要落在标志物上： 疾病治疗研究最终的成果基本都要落到标志物上。标志物可用来判断是否适合相关治疗方式、预测疗效、评估治疗效果等。
■ 试验样本规模：与筛找疾病标志物动辄需要至少成百上千的样本规模相比，疾病治疗研究由于收集样本的难度较大，且需要持续跟踪，目前并不需要那么大的样本规模。因此应该把研究的重点放在精细化试验设计，深化数据分析上，这样依然可以发表高分文章。
