随着各类技术的飞速发展，法医领域出现了很多的新兴技术，例如痕量检材的高通量测序、物证采集保护液、微生物检测技术等。这些技术的发展在当下和未来势必会给当局、受害者、受害者家庭和社会带来更多帮助，让犯罪分子无处藏身。

       身为横跨法医与科研工作的大阅哥，今天想详细谈谈法医领域中一个潜力无穷的“黑科学”——微生物学。微生物学在法医领域当中真可谓是大有用处，可以用来作为判定犯罪行为的辅助证据、推定死亡时间、鉴定死亡地点、判断死亡方式（溺死、中毒死亡、院内感染）和进行个体识别等。

       今天跟着大阅哥从几篇超经典的文献中学习一些法医微生物学研究的思路和方法，下面就让我们开始吧！

一、死亡时间评估

       法医案件中，蝇蛆等昆虫常被用来作为推定死亡时间的依据，而这些方法并不完美。近些年，研究人员将目光转向了分解死亡动物的细菌和真菌等微生物上。他们发现死亡后微生物群的演化模式与死亡时间(postmortem interval, PMI)、性别、器官类型等均有相关性。这种基于基因测序技术检测尸体上的微生物组成预测推断死亡时间的方法较于先前的方法具有时间分辨率高、模型参数多、计算更精算、可得到额外信息等优势。

经典文献分析

• 题目：Microbial community assembly and metabolic function during mammalian corpse decomposition

• 发表杂志与时间：Science(IF：41)，2016

• 样本类型：小鼠模型、人类腐烂尸体

• 检测方法：16S、18S、ITS扩增子测序

• 分析方法：PCA分析、聚类分析、PIRCUSt功能预测、环境因子关联分析、随机森林回归、动态贝叶斯推断神经信息流网络等

• 核酸提取方法：QIAGEN MagAttract PowerSoil DNA kit

       本文选取了120只雌性小鼠尸体分别置于草原、森林和沙漠不同环境土壤上，在不同时间节点收集小鼠尸体下的土壤，同时采集未受土壤污染的小鼠头部、身体皮肤和腹部肠道样品。同时将4具捐赠的人体遗体样本自然放置在不同环境和季节下，采集不同时间、部位的皮肤及土壤样品，对上述样本进行DNA提取和16S、18S及ITS扩增子测序。

       结果显示，死亡后微生物群在短时间内会发生急剧的种群变化，且这种变化是有规律的。在死亡后的前两周，微生物种群的变化主要和死亡时间而非环境相关，通过随机森林回归所预测得的死亡时间误差在2~3天。温度会影响微生物的种群，春天比冬天发现了更多的微生物种群，然而两季模型的相关性达到0.77，因此使用冬天的数据也能大致预测春天的结果。就微生物来源而言，细菌和古菌主要来自土壤，而其它环境及生物因素，如丽蝇，也可提供次要的微生物种群。

       文章末尾，研究者使用了PIRCUSt预测差异微生物的功能，结果表明，与尸解特异的基因功能发生显著变化，例如亚硝酸还原酶通路（将亚硝酸盐转换为氨盐）、赖氨酸脱羧酶通路（形成尸胺）和1，5-戊二胺、鸟氨酸脱羧酶通路（形成腐胺）等。

A. PCoA显示菌群结构随时间变显。但不同土壤类型在尸体分解菌群前3周没有明显区别。

B. 对冬季皮肤的菌群采用随机森林模型训练，并使用春天数据验证。红色为真实数据预测值与真实值分布，灰色为随机猜测的值(对照)。模型的相关性达到0.77。

C. 分解过程动态贝叶斯网络展示古菌、细菌、真核微生物、环境因子关系。箭头显示因果关系方向。

微生物与【死亡时间】科研思路建议

       研究死亡时间和微生物间的关系，样本可以使用小鼠模型，也可以使用人源尸体样本，主要取样部位为皮肤表皮。在实验分组设计上，主要分组变量应是不同时间的取样，其余需考虑的变量包括温度、季节、地点、器官、性别等。由于目前尚未得到相关性显著的特异标志微生物，且研究还聚焦在微生物种类和相对丰度上，因此实验方法建议使用16S/18S/ITS扩增子测序或宏基因组测序，待标志微生物出现后可以使用荧光定量。生信分析方法可以使用微生物测序的常规分析，得到不同分组间的差异物种和相对丰度。同时也可以加入一些高级分析，例如上述文章中采用的随机森林回归，建模预测等。

近期相关研究：

【1】Javan, Gulnaz T., et al. (2016)  "Human thanatomicrobiome succession and time since death." Scientific reports.DOI: 10.1038/srep29598 (研究死亡后不同时间内人体不同器官中的微生物变化)

【2】DeBruyn, Jennifer M., and Kathleen A. Hauther. (2017)"Postmortem succession of gut microbial communities in deceased human subjects." PeerJ.DOI: 10.7717/peerj.3437 (研究死亡后暴露在自然条件下的尸体肠道微生物的变化，并得出在丰富度、多样性和特定菌种变化结果)

二、个体识别辅助应用

       相关研究表明，不同生存环境或生活方式的个体会具有不同的微生物群落结构，每个人身体不同部位的微生物组成也不相同。微生物的这种个体化差异与独特性，表明其具有作为个体识别辅助应用的潜力。

经典文献分析

• 题目：Identifying personal microbiomes using metagenomic codes

• 发表杂志与时间：PNAS(IF：9.5)，2015

• 样本类型：人体唾液、皮肤与粪便

• 检测方法：16S、18S、ITS扩增子测序

• 分析方法：OTU聚类、物种分析、Kbwindows分析 、物种特异性标记基因、模型建立等

• DNA数据来源：使用HMP的16S测序与宏基因组测序数据进行分析

       美国哈佛大学公共卫生学院2015年发表在PNAS杂志上的一篇文章指出，每个人体内的微生物群落都含有其独特的“指纹”，此特征可作为区分个体的标识。

       研究者通过分析人类微生物组项目(HMP)产出的公开有效的微生物数据，对242位志愿者的唾液、皮肤、粪便和其他身体部位进行长达数月的调查研究后建立的微生物个人识别码，也就是所谓的微生物“指纹”。他们将这些编码与后续随访中获取的样本和另一组独立人群的样本进行比较。

       结果显示，每个人都拥有独特的微生物指纹，它们在成百上千的个体中是独一无二的，并且大部分指纹在超过一年的采样周期中保持稳定。研究人员发现，这些样本中，粪便样本的微生物指纹最为稳定，在采样一年后仍有超过80%的个人可被正确识别。

A. 三个个人及其宏基因组特征（用大写字母表示）所示。称这些特征为为宏基因组特征编码。B.三人数周甚至数月后的情况。个人1微生物一直很稳定 (真阳性）。个人2已经失去C特征编码, 不能和之前的他所对应。个人3已经失去了功能B和C，但获得D。E确保他仍保持之前的特征编码，但此时对于个人2来说则可能是个假阳性。C、利用四种微生物基因组测序后得出的参数可进行身份识别，分别为OTU、物种类别、参考基因组中的Kilobase windows(kbwindows)和物种特异性标记基因。

微生物与【个体识别】科研思路建议

       在进行微生物与个体识别研究中，样本可以直接使用人体样本。实验分组应以不同个体为主要变量，其他需要考虑到的变量包括同一个体身体的不同部位、地域地区、人种、生活环境、工作性质和年龄等。分析方法可以使用微生物测序的常规分析，同时也可以参考上述文献中总结出的不同参数，用于建模。

相关研究：

 【1】Schmedes, Sarah E., et al. (2018)"Targeted sequencing of clade-specific markers from skin microbiomes for forensic human identification." Forensic Science International: Genetics DOI: 10.1016/j.fsigen.2017.10.004 (该研究分析了来自多名健康个体中3个皮肤位点微生物群落的分支特异性标记物，可在不知情情况下准确判断个体不同身体部位，平均准确率达94％)

 【2】HANSSEN E N，et al. (2017) Body fluid prediction from microbial patterns for forensic application[J]. Forensic Sci Int Genet DOI: 10.1016/j.fsigen.2017.05.009 (该研究首先分析不同取样检材在微生物测序中的不同。然后对来自口腔和皮肤的微生物样本的16S rDNA 基因进行测序并分析，以探索个体唾液微生物的稳定性和特异性，结果显示，微生物群落较好地区分了唾液和皮肤，而不同个体的唾液微生物具有特异性，交叉验证的准确率为94%)

三、疑难/特殊案件侦破

       刑事案件中，总有一些由于犯罪技巧或者侦察技术局限等原因导致无法侦破的疑难案件，即使过了数年甚至数十年，案件的侦破对于受害者和受害者亲属来说依然是必要的公道，而对于社会和法医技术领域来说，疑难案件的侦破无疑的更是意义重大，还可能因此推动新技术的发展甚至是立法。“微生物”就有潜力被运用在一些特殊案件的侦破当中。

经典文献分析

• 题目：Metagenomic analyses of bacteria on human hairs: a qualitative assessment for applications in forensic science

• 发表杂志与时间：PNAS(IF：9.5)，2014

• 样本类型：人体毛发与阴毛

• 检测方法：16S扩增子测序

• 分析方法：OTU聚类分析、PCoA分析

• 核酸提取方法：自配体系，详见文章

       强奸案中，罪犯的认定一般是依赖从受害者身上取得的精液样本。但现在很多罪犯作案时会戴上安全套，以方便销毁证据。

       为了解决这个问题，本研究希望通过对比嫌疑人和受害者阴毛上的细菌，建立一个微生物指纹，从而确定强奸犯。研究者在5个月里采集了7个人(其中两人同居)的头发和阴毛样本，然后分别在2个月和5个月后，检查毛发上的菌群构成。结果显示，男性的头发样本中有50种不同的微生物，而女性头发样本中则有55种，不过这其中大部分微生物不具备个体差异。而阴毛样本则不同，阴毛中细菌种类更多，男性约有73种而女性有76种，且更具特异性—每个人的阴毛中都有独具“个人特色”的细菌，且5个月内也基本没有变化。结果显示，阴毛中细菌的多样性更高也更具有个人独特性，且同居伴侣的阴毛样本上细菌的相似度要更高。

男性与女性头发样本与阴毛样本微生物群落的PCA分析

微生物与【疑难案件】科研思路建议

       微生物与疑难案件的相关研究比较灵活，因为案件情况复杂多样，因此需要根据每类犯罪中的特殊情况进行实验设计。例如上文中的强奸案可以通过检测阴毛的微生物，而毒品犯罪中则可以检测物证及吸毒者的口腔微生物变化等。

相关研究：

【1】NING T，GONG X，XIE L，et al. (2017) Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditionedplace preference[J]. Front Microbiol 

DOI: 10.3389/fmicb.2017.01620 （该研究使用条件性位置偏爱(conditioned place preference，CPP)模型和粪便样本进行16S rDNA 测序研究甲基苯丙胺(冰毒)对大鼠行为的影响）

四、死亡地点或死亡方式

       在法医学领域，土壤、水体甚至植物等与案发现场相关的可疑物证可为犯罪嫌疑人和犯罪现场是否具有关联提供极为重要的证据，不同的土壤或水体有着自己特殊的微生物组成特点。以往对上述物证的检验主要包括颜色、质地、物质成分以及对地质学特征加以区别，但这种鉴别的方法存在着局限性。高通量测序技术的出现与发展，使得微生物基因测序也成为应用于法医物证鉴定的指标之一。

       本文第一篇解读文章的作者，同时也是一名世界著名的微生物生物信息学研究专家：Rob Knight，在2011年的时候开发了一款软件“Source Tracker”，该软件基于贝叶斯算法，可以探究尸体中的菌群与来源土壤的鉴定，并且推断腐败菌来自本身，还是周围环境。有助于死亡地点的判断。

SourceTracker分析图，预测样本来源比例饼图

一个饼图代表一个预测样本，不同颜色扇形的比例代表该预测样本中各来源的比例

       同时，一些微生物的检测也被用于死亡方式的鉴定，例如溺死、中毒死亡、院内感染、突然死亡等。

微生物与【死亡时地】科研思路建议

(1)不同死亡地点的特异微生物物种与死者身上微生物进行比对研究;

(2)不同死亡方式对在死亡过程中或者死亡后产生的特定微生物物种信息特征进行研究。

【1】Lee, So‐Yeon, et al. (2017)"Microbiota composition and pulmonary surfactant protein expression as markers of death by drowning." Journal of forensic sciences 

DOI: 10.1111/1556-4029.13347 (本研究使用溺死大鼠模型对肺部、肝部和心脏的微生物进行16S测序，同时检测了肺部一种特异性表达的蛋白，用于溺死的判定)

总 结

       法医微生物学其实已经不是一门新学科了，但由于之前技术条件、人员和大环境的限制，微生物学一直没有真正的运用到法医案件侦查中，相关的研究也并不是很多。微生物运用到法医当中的难点包括：

1.虽然测序技术问题不大，但是后续的分析难度大，技术水平要求高，算法复杂，需要人力和物力的投入；

2.需要一个积累大量数据的数据库用来分析比对；

3.目前缺乏共识，虽有相关研究但是相对较少，多数研究在国外进行；

4.多态性非常好的微生物种类或者结构特点还没有被找出来。

       但是，通过今天的介绍，我们知道了微生物具有巨大的潜力被运用在法医案件领域中的诸多关键问题上，包含死亡时间、地点、方式的推定以及个体识别等。当前，微生物相关研究，尤其是肠道微生物的研究非常火热，其研究技术方法，研究经验和实验思路等都较于之前有了很大提升。

       大阅哥认为现在正是让微生物研究在法医领域开花的关键时期，也正是国内法医领域迈入死亡微生物学研究的绝好契机，期待着在不久的将来，在所有法医人努力的前提下，发展出基于微生物方法的准确、实用、性价比高的方法，造福法医相关人员、受害者和社会。