CAP权威发声：当MSI与MMR检测结果不一致时如何处理
【2022-09-01】
2022年7月美国病理学家协会（CAP）在《Archives of Pathology and Laboratory Medicine》上重磅发布了《Mismatch Repair and Microsatellite Instability Testing for Immune Checkpoint Inhibitor Therapy ：Guideline From the College of American Pathologists in Collaboration With the Association for Molecular Pathology and Fight Colorectal Cancer》指南，旨在帮助肿瘤学家和病理学家准确地确定患者是否有资格使用免疫检查点抑制剂[1]。
针对于微卫星不稳定（MSI）和DNA错配修复（MMR）结果出现不一致时如何处理终于有了官方说明。第一条声明指出，如果出现不一致的结果，病理学家应将通过免疫组织化学法（IHC）检测DNA错配修复缺陷（dMMR)，或通过第二代测序（NGS）或聚合酶链式反应（PCR）方法检测微卫星不稳定（MSI）证明是MMR缺陷的任何证据解释为阳性，从而使患者有资格接受免疫疗法。另外应该对不一致的结果进行审查，以确保不一致的结果不是由于解释上的错误。
1993年，Jacobs等人在结直肠癌中首次发现MSI在肿瘤的诊疗过程中发挥重大作用。2017年，FDA批准帕博利珠单抗用于泛癌种的微卫星高度不稳定（MSI-H）/dMMR 晚期患者，使得MSI成为肿瘤领域炙手可热的泛癌种分子标志物，其可用于林奇综合征筛查、肿瘤分子分型预后预测与化疗指导、泛癌种免疫治疗疗效预测方面。
随着临床PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂的应用越来越多，为了让更多的患者能获益于免疫治疗，当MSI与MMR不一致时如何准确识别MSI-H或dMMR肿瘤的患者对临床来说仍有一定困扰。北卡罗来纳大学教堂山分校的病理学和实验室医学主席Russell Broaddus指出，这在过去的五年里给整个检测领域带来了巨大的混乱。
文献报道MSI/MMR之间的一致性可达90%以上，由于原理以及实验操作的原因，PCR法与IHC检测结果存在客观的不一致性，下面针对MSI与MMR的检测原理及常见不一致现象进行分析，从而提高临床对MSI及MMR两种检测的认识，做出准确的判断，使其更好地服务于临床诊疗。
一、MSI与MMR
微卫星指分布在整个基因组中的短串联重复序列。MSI是由于DNA复制过程中微卫星重复单元出现插入或缺失，且MMR系统无法纠正这些错误而导致的微卫星长度的变化。dMMR是MSI的主要原因。
MMR系统与MSI关系[2]
二、MSI/MMR检测方法介绍
免疫组化法检测MMR：主要检测常见四个MMR蛋白（MLH1、MSH2、PMS2、MSH6）表达情况，根据蛋白表达情况确定MMR状态。MSI多由MMR蛋白表达缺失导致的MMR功能缺陷所致，故可通过检测MMR蛋白缺失来反映MSI状态。
荧光PCR-毛细管电泳法检测MSI：通常检测正常组织和肿瘤组织中MSI位点，然后通过比较确定肿瘤样本中微卫星不稳定位点数量来判断肿瘤样本的MSI状态，是当前公认的MSI检测“金标准”方法。2019年我国《结直肠癌及其他相关实体瘤微卫星不稳定性检测中国专家共识》指出基于PCR法中的Pentaplex panel的 5~7个标志位点组合BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、MONO-27被认定为MSI PCR检测的金标准[3]。
NGS法检测MSI：MSI算法通常通过刻画选取的标志位点不同重复序列长度对应的reads个数在MSI-H和MSS中的差异来判断位点的不稳定状态，以不稳定位点比例是否超过既定阈值来确定样本的MSI状态。目前在NGS检测MSI时，由于技术复杂，不易标准化，检测位点及cut-off值没有统一标准，并且由于经济负担和资源浪费，不推荐NGS单独用于MSI检测。
三、MSI与MMR检测结果常见不一致现象及可能原因
研究显示，MMR-IHC与MSI-PCR具有90%~97.5%的一致性。但由于两种方法的检测原理不同，MMR染色异质性、MMR系统的功能补偿机制、MMR基因错义突变以及化疗等原因均可能导致MSI与MMR结果不一致。
■ 错配修复系统正常(pMMR)/MSI-H
①在MMR蛋白的异质性表达区中，MMR蛋白阳性表达的肿瘤也可能存在MMR基因突变及甲基化，表现为MSI-H[4]。
②当编码MMR蛋白的基因发生错义突变时，MMR蛋白功能出现异常但可能并不影响其抗原结构，在这种情况下，IHC能够检测到MMR蛋白的表达，但其错配修复功能异常，MSI的检测结果为MSI-H[5]。
③由于MMR涉及但不限于MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、MSH3、PMS1等一系列基因，IHC法未检测的MMR基因突变或尚未识别的MMR基因突变可能导致MMR缺陷，表现为MSI-H[6]。
④有文章报道POLE基因核酸外切酶区域的突变可以解释<1%的pMMR/MSI-H现象[5,7]。
■ dMMR/微卫星稳定(MSS)
①MMR系统功能补偿机制出现MMR表达缺失但MSS
由于MMR免疫组化只检测常见的4个蛋白，但由于MMR系统存在功能补偿，可能会出现蛋白表达缺失，但MSS状态不变。常见的补偿机制为PMS2和PMS1互补，MSH6和MSH3互补。最常见的不一致是MSH6表达缺失与MSS状态共存。
一部分原因源于MSH3对MSH6蛋白的功能补偿。当MSH6蛋白受损时，MSH2/MSH3继续工作，DNA错配修复被纠正。
同时由于MSH6主要识别单碱基的错配，使用双核苷酸位点的MSI标记对MSH6的缺陷可能会发生漏检，因此建议使用仅含单核苷酸位点的标记，以便最大限度的提高MSH6携带者的检出率[8]。
②新辅助放化疗可能会影响MMR蛋白表达
新辅助放化疗后的直肠癌可能几乎完全丧失MSH6染色或仅有核仁染色；新辅助放化疗后约30%的直肠癌出现PMS2染色减弱，表现为MSS。此时如果染色模棱两可，取放化疗前的活检标本进行IHC染色通常可以解决这个问题[9]。
③有文章报道MLH1启动子的甲基化或MLH1基因的致病性突变可以解释多数MLH1蛋白缺失且MSS的现象[5,7]。
除了上述情况外，肿瘤的异质性、免疫组化的染色及质控等环节都可能造成MMR与MSI不一致。CAP最新指南指出，当出现MSI与MMR结果不一致时，应该对不一致的结果进行审查，以确保不一致的结果不是由于解释上的错误。所以为了更多地筛选出真正的阳性患者，让更多地患者获益，不管在LS的筛查、肿瘤患者治疗指导及免疫检查点抑制剂治疗前，都建议MMR和MSI进行联合检测。
参考文献：
[1] Angela N.et al. Mismatch Repair and Microsatellite Instability Testing for Immune Checkpoint Inhibitor Therapy: Guideline From the College of American Pathologists in Collaboration With the Association for Molecular Pathology and Fight Colorectal Cancer. Arch Pathol Lab Med 2022; Doi: 10.5858/arpa.2021-0632-CP
[2] Sinicrope FA. Lynch Syndrome-Associated Colorectal Cancer. N Engl J Med. 2018 Aug 23;379(8):764-773. Doi: 10.1056/NEJMcp1714533
[3] 袁瑛. 结直肠癌及其他相关实体瘤微卫星不稳定性检测中国专家共识 [J]. 实用肿瘤杂志, 2019, (5): 9.
[4] McCarthy AJ, et al. Heterogenous loss of mismatch repair (MMR) protein expression: a challenge for immunohistochemical interpretation and microsatellite instability (MSI) evaluation. J Pathol Clin Res. 2019 Apr;5(2):115-129. Doi: 10.1002/cjp2.120
[5] Stelloo E, et al. Practical guidance for mismatch repair-deficiency testing in endometrial cancer. Ann Oncol. 2017 Jan 1;28(1):96-102. Doi: 10.1093/annonc/mdw542
[6] Shia J.(2008).Immunohistochemistry versus microsatellite instability testing for screening colorectal cancer patients at risk for hereditary nonpolyposis colorectal cancer syndrome. Part I. The utility of immunohistochemistry. J Mol Diagn. Doi: 10.2353/jmoldx.2008.080031
[7] Stelloo E, et al.(2017). Practical guidance for mismatch repair-deficiency testing in endometrial cancer. Ann Oncol. Doi: 10.1093/annonc/mdw542
[8] Wu Y,et al.(1999). Association of hereditary nonpolyposis colorectal cancer-related tumors displaying low microsatellite instability with MSH6 germline mutations. Am J Hum Genet. Doi: 10.1086/302612
[9] Markow M,et al.(2017). Immunohistochemical Pitfalls: Common Mistakes in the Evaluation of Lynch Syndrome. Surg Pathol Clin. Doi: 10.1016/j.path.2017.07.012
