只用16S测序就把胃肠道疾病关系文章发表在了《Gut》杂志上，怎么做到的？
【2020-06-23】
众所周知，幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori, Hp）是一种常见的细菌，主要在胃部生存，Hp感染会影响到胃部的健康，且与胃癌发生密切相关。北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所的游伟程、潘凯枫、张阳团队，在山东省临朐县胃癌高发区进行研究，探究Hp感染对胃肠道微生物群落的影响。此研究近日发表在胃肠道疾病研究领域顶尖期刊《Gut》上,该课题的思路和设计非常值得大家学习研究。
【文章概览】
Effect of Helicobacter pylori on gastrointestinal microbiota: a population-based study in Linqu, a high-risk area of gastric cancer
(DOI: 10.1136/gutjnl-2019-319696)
幽门螺旋杆菌感染对胃肠道微生物影响研究——基于山东省临朐县胃癌高发区的一项人群研究
期刊：《Gut》
发表时间：2019年12月19日
IF：17.943
该项研究在山东省临朐县胃癌高发区开展，共纳入58例Hp根除治疗成功、57例Hp根除治疗失败病例，以及49名Hp感染阴性对照。对治疗前、后和阴性对照的胃粘膜及粪便样本进行菌群分析，发现Hp感染可诱导胃内菌群的显著改变，根除治疗成功可使胃内菌群恢复至与阴性对照者相似水平，根除治疗失败则无法恢复胃内菌群。进一步研究提示，Hp感染相关的胃内菌群失调可能参与胃粘膜癌前病变的发展，与胃癌的发生相关。
Fig1. 实验设计流程图
【主要结论】
■ Hp感染诱导胃部菌群多样性降低，根除治疗成功可使菌群多样性上升，接近未感染者水平
胃粘膜样本16S测序结果显示：Hp阳性受试者中，Hp根除治疗成功可显著提升胃部菌群的丰富度及shannon指数，和阴性对照样本无显著差异。Hp根除治疗失败后的胃部菌群与治疗前无显著变化，且显著低于阴性对照。粪便样本16S测序结果显示：菌群丰富度及shannon指数与Hp根除治疗成功或失败均无显著相关，且与Hp阴性样本无显著差异。胃粘膜菌种组成结构在根除治疗成功前、后具有显著差异，且在治疗后（无论治疗是否成功）均与阴性对照样本差异较大。肠道菌种组成结构在治疗（治疗成功或失败）前、后均具有显著差异。
Fig2. 不同分组样本Shannon指数；A：胃粘膜样本 B：粪便样本
■ Hp根除成功后胃肠道多个物种丰度发生改变，从中选择18个属水平物种用于后续分析
研究发现，根除治疗成功后，胃内共有194个不同级别的物种丰度发生显著改变。其中，5种与Hp相关的物种丰度显著降低，按照分类级别依次是变形菌门、ε-变形菌纲、弯曲菌目、螺杆菌科和螺杆菌属。与此同时，拟杆菌门、梭杆菌门、放线菌门和厚壁菌门的物种显著升高。根据胃粘膜样本测序分析结果，共计18个在成功根除Hp后丰度显著变化的菌属（17个上升，1个下降）被选为候选标志物，用于后续分析。在粪便样本中，共有21个不同级别物种丰度在根除治疗成功后发生显著变化。
Fig3. Hp成功根除后菌群结构和丰度变化 A：胃粘膜样本 B：粪便样本
■ 根除治疗成功组胃粘膜与粪便样本中微生物相关功能均发生改变，治疗失败后肠道菌群中耐药相关通路表达上升
基于16S测序结果，该项研究利用Tax4Fun进行微生物相关功能预测分析。在根除治疗成功后，共计253个功能通路在胃粘膜样本中发生显著改变，其中包括菌鞭毛组装、细菌趋化和细菌分泌功能的下降；蛋白消化吸收、粘多糖降解和胃酸分泌等功能通路上升。粪便样本功能预测结果显示，根除治疗成功和失败组中分别共有71和48个功能通路改变，尤其在失败组中观察到一些耐药相关蛋白功能的表达上升。
■ MDI指数评估胃部菌群紊乱程度及其与胃粘膜癌前病变的关系
结合根除治疗后胃粘膜样本中选出的18个差异性菌属，该研究计算出胃部菌群紊乱指数（MDI），发现Hp根除治疗成功可显著降低MDI；而Hp根除治疗失败前、后，MDI始终保持较高水平，无显著变化。此外，MDI与胃部菌群多样性指数间存在显著负相关关系。
Fig4. 不同分组间MDI指数
A：研究分组依次为治疗成功前、治疗成功后、治疗失败前、治疗失败后和阴性对照胃黏膜组织
B：病理分组依次为健康/浅表性胃炎（Normal/SG），慢性萎缩性胃炎（CAG）和肠上皮化生/异型增生（IM/DYS）
为了进一步探究胃部菌群紊乱和癌前病变之间的关系，该研究分析发现随着胃粘膜病变严重程度逐渐增加，MDI指数在慢性萎缩性胃炎（CAG）、肠上皮化生/异型增生（IM/DYS）患者中显著上升。
进一步研究发现，螺杆菌属在CAG和IM/DYS组中相对丰度显著上升，而另外九种菌属相对丰度显著下降，如拟普雷沃菌属, 梭杆菌属、奈瑟氏菌属等。利用这10种菌属进行相互作用网络分析，发现在CAG和IM/DYS组中，菌属间相互作用显著增强，尤其体现在螺杆菌属与其他9种菌属的相互作用上。
Fig5. 10种显著变化菌属的相互作用图谱 A.Normal/SG组 B.CAG组 C.IM/DYS组
【文章评述】
本研究结果显示：Hp感染会导致胃部菌群的紊乱，但根除治疗成功可以逆转失调的菌群结构并增加菌群多样性，使菌群状态恢复至与阴性对照相似的水平。同时发现Hp感染所导致的胃部菌群失调可能与胃粘膜癌前病变相关，Hp及其相互作用菌属可能共同参与胃黏膜病变的发生发展机制。本研究将胃癌高发地区、Hp感染、根除治疗和胃粘膜癌前病变等多因素融合，进行详尽细致的研究，具有创新性。
在研究设计方面:
1. 该研究采用自身对照，比较受试者治疗前、后菌群的变化，尽量避免了成组比较中个体差异导致的偏倚。
2. 该研究同时采集受试者胃粘膜和粪便样本进行测序，综合分析根除Hp治疗对整个消化道菌群的影响，而不仅仅局限在胃部菌群的变化，值得后续研究者学习。
3. 取样地点选取山东省临朐县，首先在饮食结构上保持因素单一，其次该县为胃癌高发地，具有很高的研究意义。
但小编认为，此项研究还可以通过增加样本量、加入代谢组学验证等方式进一步提升研究水平。总之，该文章为Hp感染相关胃粘膜病变的发生机制和预防策略研究提供了新的视角和理论基础。
